Использование методов in vitro в селекции растений. Современные проблемы науки и образования В условиях in vitro

УКОРЕНЕНИЕ – КЛЮЧЕВОЙ ЭТАП РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ IN VITRO

В.И. ДЕМЕНКО, К.А. ШЕСТИБРАТОВ, В.Г. ЛЕБЕДЕВ

(Кафедра плодоводства)

журнал Известия ТСХА, выпуск 1, 2010 год

В статье представлены результаты многолетних исследований о влиянии различных регуляторов роста, углеводов, длительности пассирования, качества агара, структуры среды, солевого состава питательной среды на корнеобразование. Обсуждаются этапы ризогенеза и их продолжительность. Особое внимание уделепо проблеме этиоляции, физическим факторам, гормональном и солево­му состав питательной среды. Содержатся важные и достоверные сведения о влиянии света, состава среды на ризогенез, жизнедеятельность растений и не­стерильных условиях.

Ключевые слова: in vitro , регуляторы роста, питательная среда, ювениль-ность, этиоляция, углеводы, земляника, яблоня, груша, сирень, роза, актини­дия китайская, ясень обыкновенный.

Процесс корнеобразования - это серия различных биохимических, физиологических и гистологических событий. Близость к сосудистым тканям предрасполагает клетки за­кладывать корневые примордии . Место заложения корней влияет на жизнеспособность укорененных рас­тений, особенно полученных in vitro. Можно получить 100% укоренение in vitro и 100% гибель растений в не­стерильных условиях . При лю­бых способах укоренения процесс адвентивного корнеобразования про­ходит 3-4 этапа: индукция, инициация, появление корней за пределами стеблевой части черенка . Продолжительность первых двух этапов 10-15 дней, за этот период предкомпетентные клетки приобретают спо­собность регенерировать меристематические очаги, в них начинается синез корнеспецифических белков . Появление корней зависит от генома растений и условий укоренения.

Одна из особенностей размноже­ния растений in vitro - ювенилизация тканей, что является причиной легкости ризогенеза in vitro . Сте­пень ее проявления зависит от усло­вий культивирования, и в первую очередь от содержания в сосудах эти­лена .

Предпосылкой для начала корне­образования при любых способах раз­множения является этиоляция. При­чина влияния этого феномена связана с анатомическими и биохимическими изменениями, а также с ювениализацией тканей. У этиолированных че­ренков выделены белки-рецепторы, обладающие высоким сродством с аук­сином. В темноте большая часть аукси­на связана с белками . Этиоляция повышает активность пероксидазы, ИУК - оксидазы в тканях, что уско­ряет начало образования корней. Она усиливает чувствительность тканей к экзогенному ауксину, давая возмож­ность использовать меньшие концен­трации. Характер действия этиоляции in vitro зависит от вида растений и имеет пролонгирующий эффект . Укоренение in vitro происходит при освещении всего черенка, что сказы­вается на ризогенезе и частично мо­жет нивелироваться ИМК, которая в меньшей степени стимулирует син­тез этилена по сравнению с ИУК . Основная проблема успешного ризогенеза in vitro заключается в труд­ности разделения момента заложения первого корневого примордия с нача­лом синтеза этилена. При этом очень высокий или очень низкий уровень этилена отрицательно влияет на уко­ренение . Свет выполняет важную роль в регулировании морфогенетических процессов. Облучение уже образовавшихся корней светом подавляет удлинение корней на 40-50%, за счет 4-кратного увеличения содержания этилена . Для трудно укореняе­мых видов рекомендуют использовать темновой период на начальном этапе укоренения. Его продолжительность зависит от культуры и колеблется от 3~5 дней до 4 недель. Ряд авто­ров отмечают сложную зависимость укоренения от светового режима, ре­гуляторов роста, рН среды . Положительное действие этиоляции на этапе пролиферации побегов за­висит от сорта. Применение ауксинов и темноты на последней неделе про­лиферации побегов М27 уменьшало укореняемость на 65% .

Действие ферментативных систем, которые катализируют разрушение ИУК, осуществляется только в при­сутствии кислорода. Питательные среды, применяемые для укоренения побегов in vitro, содержат очень мало кислорода, что не способствует раз­витию корневых волосков.

Поэтому подходы к укоренению in vitro должны отличаться от уко­ренения in vivo. Современное про­мышленное размножение растений in vitro невозможно без использования регуляторов роста. Как правило, для укоренения используют аналоги ИУК. Отношение к экзогенному ауксину, времени и способу его применения in vitro неоднозначно. Достаточное количество заложившихся корней и хорошая приживаемость растений в нестерильных условиях получены при экспозиции 7 дней на среде с аук­сином. Более длительное воздействие приводит к образованию каллуса . Побеги легкоукореняемых культур можно укоренять на средах без аук­синов. Однако ауксины часто не яв­ляются лимитирующим фактором и для трудно укореняемых видов.

Кроме веществ из группы ауксинов отмечают стимулирующее влияние ретардантов на укоренение и харак­тер развития корней . Неко­торые из них активируют транспорт ИУК, углеводов к базальной части черенка. Методика укоренения in vit­ro позволяет контролировать физиче­ские факторы, гормональный и соле­вой состав питательной среды. В то же время освещение основания по­бега, длительное воздействие аукси­ном, разнокачественность побегов, незначительный замкнутый объем, отсутствие или недостаточно интен­сивный газовый обмен, его специ­фичность, недостаточное содержание кислорода в зоне укоренения, воз­можная латентная стекловидность по­бегов, отсутствие транспирации, фо­тосинтеза и воздействия ультрафио­летовой радиации создают проблемы для укоренения и последующей при­живаемости растений в нестериль­ных условиях. Оптимизация этих факторов и их взаимодействия явля­ются основной задачей исследований ризогенеза in vitro. В подавляющем большинстве опытов по укоренению in vitro исследователи отмечают важ­ность осмотического потенциала сре­ды, который зависит от концентрации сахарозы, солевого состава, особенно азота и калия . Как правило, мине­ральный состав среды М.С. уменьша­ют в 2-8 раз или заменяют на сре­ду Уайта . При этом ведущая роль отводится содержанию нитратного и аммиачного азота . Отсутствие той или иной формы азота отрицательно влияет на укоренение побегов .

Пригодные для укоренения побе­ги плодовых культур формируются только после длительного культиви­рования. Даже на 11-14-м пассаже укоренение трудноукореняемых ви­дов растений представляет серьез­ную проблему . Однако очень дли­тельное пассирование нежелательно, особенно для видов, вегетативное по­томство которых предназначено для многолетних насаждений.

Считается перспективным укоре­нение побегов, полученных in vitro, в стерильных субстратах при повышен­ной влажности либо в атмосфере ис­кусственного тумана . По способ­ности к укоренению in vitro в научной литературе представлен широкий ди­апазон данных - от легко укореняе­мых видов (земляника) до отсутствия укоренения (груша каллариана) . Поэтому неудивительно, что многие авторы считают успешное укоренение побегов in vitro ключевым этапом микроклонального размножения .

Материалы и методика

Способность к укоренению in vitro земляники, яблони, груши, сирени, роз, актинидии китайской, ясеня обыкновенного изучали: с использо­ванием различных регуляторов роста (ИУК, ИМК, НУК, культар, мивал. крезацин, гумат натрия, азотнокис­лое серебро); углеводов (сахароза, глюкоза, мальтоза, фруктоза, сор­бит, маннит); ПАВ (твин-40, КЭП); влияния длительности пассирования и качества побегов, агара и его заме­нителей, структуры среды и воздей­ствия физических факторов, солево­го состава питательной среды. Расте­ния выращивали по общепринятым методикам с учетом специфики этапа укоренения. Учитывали начало корнеобразования, развитие каллуса, количество корней, рост побега. В каждом варианте по 10-14 растений в четырех повторностях.

Результаты и их обсуждение

Способность боковых побегов к уко­ренению in vitro во многом определя­ет эффективность технологии микроклонального размножения. Это наи­более затратная статья (75% затрат ручного труда) в стоимости конечной продукции. Успешное прохождение этапа ризогенеза зависело от культу­ры, сорта, условий этапа пролифера­ции, солевого и гормонального соста­ва среды, количества пассажей. Толь­ко побеги земляники были способны к укоренению на первом пассаже, а ро­бинии и вейгелы на втором пассаже. Укоренение земляники зависело от солевого состава среды и ее формы. Среда Фоссарда лучше подходит для укоренения земляники. Корневая си­стема на этой среде отличалась силь­ным ростом, была окрашена и име­ла боковые корни. Растения на среде Фоссорда были развиты сильнее, имели 4-5 листьев темно-зеленого цвета. Развитие каллуса отсутствова­ло. Менее концентрированные среды уменьшали укореняемость и угнетали развитие корневой системы.

Среда М.С. стимулировала укоре­нение и развитие каллуса у основания побега, а наличие каллуса нежела­тельно, так как при пересадке рас­тений в нестерильные условия они погибают от ботритиса. фузариоза и питиума. Сокращение в среде М.С. макроэлементов или азота на 1/2 или 4/5 увеличивало укоренение прак­тически всех изучаемых культур, а корнеобразование происходило при более низких концентрациях ауксина. На полной среде М.С., содержащей 0,5 мг/л ИМК, развивались толстые, короткие корни. На бедных средах корни были нитевидные и развива­лись из основания побега.

Характер развития корневой си­стемы зависел от типа регулятора роста, индуцирующего корнеобразо-вания. Стимулирующее влияние ИМК и ИУК в опытах с земляникой в большей мере проявилось на твердых средах, а НУ К - на жидкой. Более мощная корневая система образова­лась на жидкой среде, содержащей НУК. Однако развитие надземной си­стемы не происходило, что связано со способностью НУК поглощаться и перемещаться по растительным тка­ням. На всех средах отмечено интен­сивное развитие каллуса, особенно на средах с НУК. С учетом недостатков ауксина на этапе укоренения in vitro необходим поиск других веществ, ко­торые стимулировали бы быстрое раз­витие корневой и засухоустойчивость надземной систем. Из литературных источников известно, что такими свойствами обладает культар, кото­рый хорошо себя зарекомендовал на интактных растениях при зеленом черенковании (табл. 1).

С увеличением концентрации куль­тара в среде происходило ингибирование роста надземной и корневой систе­мы, которые отличались интенсивным радиальным ростом. Использование культара в диапазоне концентраций 0.3-0.5 мг/л также ингибировало развитие надземной системы, однако в меньшей степени. Развитие каллуса не отмечали ни в одном из вариантов. Концентрация культара свыше 1 мг/л вызывала гибель побегов. Укоренение побегов in vitro возможно только при определенной их длине. Ни одно из испытанных веществ не способствова­ло развитию корней непосредственно из меристематической верхушки, т.е. в начале необходим рост растяже­нием, а затем начинают развивать­ся корни. Введение в среду культара (0,1-0,2 мг/л) полностью ингибирова­ло рост растяжением меристематических верхушек и вызывало развитие у них корневой системы. Часть кор­ней была окрашена в зеленый цвет, т.е. корневая система приняла на себя функцию фотосинтезирующего орга­на при отсутствии роста надземной системы. Культар в концентрации 0,5 мг/л стимулировал развитие кор­ней второго, а в некоторых случа­ях - третьего порядка у сирени.

С целью устранения отрицатель­ного влияния ауксинов на процесс корнеобразования in vitro испытыва­ли вещества из группы кремнийор-ганических соединений (мивал, крезацин, КЭП) и гумат натрия. Приме­нение мивала и крезацина сущест­венно повлияло на укоренение и раз­витие корневой системы земляники, актинидии китайской, груши. Опти­мальные концентрации испытанных веществ находятся в диапазоне 0,1-2 мг/л, в котором изменяются все параметры развития корневой систе­мы. Увеличивается процент укорене­ния, количество корней и их длина (табл. 2).

Укореняемость побегов земляники при сочетании кремнийорганических соединений с другими индуктора­ми корнеобразования зависела от их концентраций. Укоренение ингибировалось полностью, если концентра­ция мивала и крезацина превышала 2 мг/л в сочетании с ИМК и при со­вместном их введении в питательную среду.

Аналогичное влияние совмест­ного применения ИМК с кремнийор-ганическими соединениями отмечено в опытах с грушей. Стимулирующее влияние крезацина проявляется в бо­лее узком диапазоне концентраций (0,1-0,2 мг/л), а мивала при концен­трациях 0,1-0,5 мг/л.

Можно предположить, что мивал обладает ауксиноподобным действи­ем, но при этом не стимулирует раз­витие каллуса. При низких концен­трациях мивала и крезацина наблю­дается синергизм действия с ИМК на процессы роста и развития земляни­ки in vitro - увеличивается высота растения за счет длины побегов и ли­стьев.

Раздельное применение мивала и культара в малых концентрациях способствовало 100% укоренению земляники; совместное использование при больших концентрациях полно­стью ингибировало корнеобразование. Актинидия китайская в отличие от земляники максимально увеличива­ла развитие корней от совместного применения ИМК с мивалом, при этом концентрация ИМК также пре­вышала концентрацию мивала. Со­вместное действие мивала и крезаци­на ингибировало укоренение данной культуры. Очевидно, актинидия тре­бует большей концентрации ауксина на этапе индукции по сравнению с земляникой. Потому высокие концен­трации ИМК в большей степени сти­мулировали корнеобразование акти­нидии, если ее применяли отдельно.

Существенно ускоряли прохожде­ние этапов укоренения побегов зем­ляники гумат натрия и азотнокислое серебро. Их использование в концен­трации 0,5-1 мг/л сократило время начала укоренения побегов, ускоря­ло получение растений, пригодных к пересадке в нестерильные условия. Данные наших опытов с азотнокис­лым серебром и метионином дают нам основание утверждать, что на первом этапе укоренения значительный син­тез этилена ингибирует заложение корней. Введение в питательную сре­ду метионина полностью подавля­ло ризогенез в вариантах с ИМК и мивалом и значительно в вариантах совместного действия индукторов корнеобразовавния. Очевидно, что метионин увеличивает содержание этилена в фазу индукции заложения корней до ингибиторного уровня.

На всех этапах микроклонального размножения в питательных сре­дах используют углеводы, в основном сахарозу, как наиболее мобильный углевод. Углеводы в культуре тканей имеют значение не только как эле­менты питания, но и как вещества, создающие вместе с солевым составом определенное осмотическое давление. Значение углеводов возрастает на этапе укоренения в связи с необхо­димостью подготовки растения к автотрофному питанию в нестерильных условиях. Концентрация углеводов сахарозы, фруктозы, глюкозы 10 г/л недостаточна для укоренения земля­ники. Маннит и сорбит, не имеющие пищевой ценности, но обладающие способностью влиять на осмотическое давление, также не способствовали образованию корней. Появление пер­вых корней на побегах ясеня отмеча­лось на 9-10-й день после посадки на среду для укоренения. Влияние испы­танных углеводов зависело от приме­няемых регуляторов роста (табл. 3).

Различные углеводы не оказали су­щественного влияния на частоту уко­ренения: в варианте с НУК она соста­вила 86-93%, а в варианте с ИМК - 55-71%. Однако количество корней и их длина различались сушественно: максимальные значения отмечены на среде с 30 г/л сахарозы или 10 г/л глюкозы. Корни на среде с мальтозой были в 2,4 раза короче, чем на среде с сахарозой, и в 3,2 раза - чем на среде с глюкозой, при этом растения отставали в росте от растений на сре­дах с сахарозой и глюкозой.

Рост и развитие корней in vitro за­висят от аэрации питательной среды, которая, в свою очередь, зависит от концентрации агара. Укоренение по­бегов в плотной среде затруднено, развитие корней второго порядка не происходит. С уменьшением концен­трации агара существенно увеличи­вается укоренение побегов и развитие корней второго порядка.

Однако при длительном развитии растений на средах с малым содер­жанием агара (1,5-2,5 г/л) у них по­являются признаки стекловидности. На питательных средах, содержащих даже небольшие концентрации ага­ра, никогда не развиваются корневые волоски, что говорит о недостаточ­ном содержании кислорода. С учетом важности содержания кислорода при заложении и развитии корней и кор­невых волосков делали попытки за­менить агар на этапе укоренения. При использовании полной среды М.С. и заменителей агара побеги погибали уже через несколько дней после по­садки. Гибель побегов и растений, начавших развивать корни на среде 1/2 М.С. и заменителях агара (перлит, песок), была связана с иссушением верхнего слоя субстрата.

Агар стимулировал более раннее корнеобразование. Возможно, он по­вышает диффузию веществ из пи­тательной среды, а также помогает диффузии веществ из экспланта, ингибирующих корнеобразование. Боль­шая часть укоренившихся побегов в вариантах с заменителями агара при­жилась в нестерильных условиях, од­нако их рост в дальнейшем был сла­бым. Объединение агара с перлитом способствовало получению хорошо развитой корневой системы земля­ники, которая обеспечила успешную приживаемость растений в несте­рильных условиях. Сочетание перли­та с агаром дает возможность умень­шить концентрацию агара в 3 раза. После автоклавирования и застыва­ния среды в сосудах для укоренения образуются два слоя: вверху перлит, пропитанный средой, внизу агаровая среда с вкраплениями частиц перлита (табл. 4).

Соотношение перлита и питатель­ной среды с агаром 0,5-1:1 по объему было оптимальным. Использование такой среды для укоренения груши не дало положительных результатов.

Существующая методика укорене­ния боковых побегов большого чис­ла видов с использованием ауксинов возможна только после длительного пассирования. Положительное влия­ние на размножение, возможно, свя­зано с ювенилизацией растительного материала. Не исключена вероятность стимулирующего эффекта этиоляции, так как с увеличением количе­ства пассажей увеличивается коли­чество боковых побегов, основание которых, как правило, этиолировано. Спуровые формы яблони и клонового подвоя 62-396 начали хорошо укоре­няться с 12-13 пассажа. Укоренение их зависело от солевого состава пита­тельной среды. Укоренение древесных растений на более поздних пассажах создает биологические и организа­ционные проблемы, которые отчасти решаются хранением культур на ста­дии пролиферации при пониженных температурах. Однако действие этого фактора может иметь отрицательные последствия на укоренение (влияние этиоляции и низких положительных температур). В связи с этим изучали влияние условий освещения на укоре­нение боковых побегов яблони in vitro (табл. 5). Результаты опытов выяви­ли определенную зависимость между влиянием света, низкой температу­рой, регуляторов роста и укоренени­ем побегов.

При использовании в качестве индуктора корнеобразования ИМК укореняемость побегов повышалась на 14-30%, если пролиферирующие культуры подвергались воздействию темноты, особенно в сочетании с низкими положительными темпера­турами. Отсутствие света на этапе размножения существенно уменьши­ло укоренение в варианте с культаром и мивалом, особенно в варианте с культаром. Низкие положительные температуры уменьшили ингибирующее действие этиоляции в данных вариантах.

Если индукция укорене­ния (15 дней) проходила в условиях этиоляции, то укоренение умень­шалась на 10-64% в зависимости от индуктора корнеобразования. Как уже отмечалось, в укоренении ос­новную роль играют ауксины, син­тезируемые эксплантами. Они необ­ходимы на этапе индукции корнеобразования, который продолжает­ся 6-10 дней. Отсутствие света при хранении и укоренении стимулирует корнеобразование только в присутст­вии ИМК.

Сокращение темнового периода до 5-10 дней увеличило укореняемость побегов подвоя 62-396 на 24% при ис­пользовании ИМК. Хранение конгло­мератов земляники при низких поло­жительных температурах перед уко­ренением побегов влияло на скорость прохождения этапов корнеобразова­ния (табл. 6).

Последействие низких положитель­ных температур зависело от индук­тора корнеобразования. ИМК ускоря­ла, а культар тормозил прохождение этапов корнеобразования при таких условиях. Многочисленные опыты по зеленому черенкованию убедительно показывают, что укоренение черен­ков сильно ингибируется, если их по­местить полностью в условия темноты (она необходима только для основа­ния черенка). С учетом такой реакции черенков на отсутствие света мы ис­пытывали различные способы зате­нения основания побега in vitro. По­беги подвоя 62-396 сажали в капсулу из фольги, заполненную питательной средой, или в питательную среду вводили активированный уголь. Наи­больший процент укоренения (86%) отмечен в варианте с использованием капсулы. Введение активированного угля в среду уменьшало укоренение на 35%. Известно, что 1 мг активированного угля может поглотить 100 мкг 6БАП и НУК. В активированном угле содержатся феноламиды, что может отрицательно влиять на укоренение. Активированный уголь поглощает этилен, который неоднозначно влия­ет на процессы ризогенеза. Использо­вание капсулы для укоренения стиму­лировало интенсивный рост корневой системы в длину, развитие корней второго порядка. Однако использо­вание капсулы не технологично. Нами разработана композиционная среда, которая значительно улучшает уко­ренение яблони за счет эффекта этиоляции. Отличительной особенностью такой среды от стандартной являет­ся размещение на стандартной среде укоренения или размножения слоя среды (2-3 мм), состоящего из воды, агара и активированного угля (2-5%). Композиционная среда способство­вала укоренению побегов после 4-го пассажа, увеличению в 2 раза обще­го числа корней, корней второго по­рядка и стимулировала ризогенез на средах, содержащих 6БАП. Через 1,5 мес длина укоренившихся побегов на среде, содержащей 6 мг/л 6БАП. увеличилась в 2 раза. Прирост побегов в контроле составлял 27% от опытно­го варианта. Свет (стандартная среда) ингибировал рост корней в длину и развитие корней второго порядка. На композиционной среде корни разви­вались между основной средой и за­темненным слоем. К концу пассажа на корнях развились корневые волоски. Если стенки сосуда затемняли фоль­гой, то корневая система развивалась и внутри среды. На основании полу­ченных данных укоренение древесных растений необходимо начинать уже после 4-5-го пассажа. Побеги длиной больше 2,5 см следует использовать для дальнейшего размножения, так как у них отсутствуют предпосылки возникновения стекловидности. Побе­ги длиной меньше 1,5 см необходимо пересаживать на среду с понижен­ным содержанием 6БАП (0,1 мг/л), а побеги 1.5-2,5 см - использовать для укоренения.

Жизнеспособность растений в не­стерильных условиях во многом опре­деляется способностью растений in vitro и in vivo к быстрому росту. В условиях in vitro это свойство зави­сит от культуры, регуляторов роста, условий выращивания. Часто на этом этапе отмечается гибель верхушек укорененных растений. В этой связи изучали влияние электростатическо­го поля (10-40 квт/м) на укоренение побегов груши на фоне различных ре­гуляторов роста. Электростатическое поле изменяло характер ризогенеза и рост укорененных побегов. В лучших опытных вариантах количество жиз­неспособных побегов было больше на 47,5%, их длина превышала длину контрольных на 17%, увеличилось количество корней и их длина.

Размер боковых побегов влиял и на укоренение их in vitro. С увели­чением длины боковых побегов уве­личивается количество корней, их длина, высота растений и уменьшается количество листьев. Скорость роста надземной системы была выше у побегов длиной 0,5 см. Увеличение количества листьев у побегов неболь­шого размера, очевидно, связано с остаточным действием 6БАП. Не ис­ключено, что небольшой рост побегов объясняется превалированием у них роста делением на этапе пролифе­рации побегов, которое реализуется увеличением количества листьев на этапе укоренения.

Укореняемость побегов яблони также зависела от их длины. Корот­кие побеги клонового подвоя 62-396 были способны к укоренению, но раз­витие надземной и корневой системы было слабое. Эффективным приемом повышения укоренения побегов яв­ляется травмирование их основания, особенно продольные надрезы побе­гов. При таком способе на 27% уве­личилась укореняемость и в 4 раза - количество корней спуровой формы ялони.

Прохождение основных этапов микроклонального размножения либо невозможно, либо очень затруднено без включения в состав питатель­ной среды регуляторов роста. Для получения желаемой направленно­сти морфогенеза иногда приходится применять их в больших концентра­циях, что может вызвать побочные нежелательные реакции (образова­ние каллуса, стекловидности, пре­ждевременную гибель отдельных органов). Вместе с тем известно, что действие регуляторов роста опреде­ляется их способностью проникать в клетку. Ослабить некоторые барьеры проникновения веществ в клетку мо­гут поверхностно-активные вещества (ПАВ). Действие твин-40 зависело от его концентрации, положитель­ное влияние отмечено в вариантах с твин-40 (0,5-1 мг/л). При такой концентрации начало и интенсивность корнеобразования проходили при бо­лее низком содержании в среде ин­дукторов корнеобразования (0,1 мг/л ИМК). Более высокие концентрации твин-40 снижали способность побегов земляники к ризогенезу. Более активным в этом процессе был гумат нат­рия в концентрации 0,5 мг/л.

Получение целостного растения in vitro и характер его развития зави­сели от солевого и гормонального со­става среды, предшествующей уко­ренению.

Процесс корнеобразования боко­вых побегов роз лучше протекал, если предыдущий пассаж размноже­ния проходил на среде, в которой со­отношение NH4: N03 было 1: 2. При таком соотношении существенно уве­личилось количество корней и их длина. Высота надземной системы не зависела от соотношения аммиачно­го и нитратного азота. Укоренение боковых побегов груши зависело от содержания в питательной среде для размножения 6БАП (табл. 7).

Несмотря на отсутствие взаимо­связи между концентрацией 6БАП и последующим укоренением побегов, имеется тенденция ее возрастания с увеличением концентрации 6БАП. Уменьшается число растений с по­гибшими верхушками и ингибируется способность корней первого порядка к ветвлению. Такая реакция груши на 6БАП согласуется с его физиологи­ческими свойствами как цитокинина. Изучение качественного состава по­чек в процессе пассирования земляни­ки показало, что при использовании в питательной среде больших концен­траций 6БАП (1 мг/л) у всех сортов (Фрагинета, Хавеланд, Заря, Ко-кинская ранняя, Редгонтлит, сеянец 139-13-11) начиная с 4-5-го пассажа увеличивается количество почек, не­способных к развитию полноценных растений. По-видимому, это связано с длительным воздействием высокой концентрацией 6БАП.

Агар - наиболее часто исполь­зуемый гельобразующий материал в культуре ткани. Он наиболее дорогой компонент среды. В связи с этим ве­дутся поиски заменителей агара, кото­рые обладают гелирующими свой­ствами. В своих опытах проводили испытание гельрайта*. Использование гельрайта (0,5-2,5 г/л) при укорене­нии подвоя 62-396 стимулировало развитие стекловидности. Количество стекловидных растений уменьшалось, если гельрайт применяли вместе с агаром (2,5 г/л). Такая реакция рас­тительных тканей, возможно, свя­зана с его способностью поглощать двухвалентные катионы.

Выводы

1. Укоренение побегов земляники возможно на первом, робинии и вейгелы на втором пассаже, яблони и гру­ши после 5-10-го пассажа в зависи­мости от гормонального и солевого со­става среды. Сокращение в среде М.С. на 1/2 макроэлементов или на 1/2 -1/3 общего азота способствует увеличе­нию укоренямости побегов земляники и яблони.

2. Характер укоренения побегов in vitro зависит от используемых индук­торов корнеобразования, их концетра-ций и сочетаний. При введении в пита­тельную среду гумата натрия, креза-цина, мивала, культара существенно увеличилось укоренение, уменьшилось развитие каллуса. Культар способство­вал развитию корневой системы не­посредственно из меристематической верхушки размером 250-300 мкм, при этом корни были окрашены в зеленый цвет. Применение ПАВ (КЭП, твин-40) повышало активность ИМК в 2 раза и уменьшало активность культара в 6 раз, позволяло проводить этап укоре­нения при более низких концентрациях ауксинов. Совместное применение ИМК и AgN03 ускоряло начало корнеобра­зования у земляники.

3. Укоренение побегов яблони зави­село от способа и продолжительности этиоляции, температурного режима и регуляторов роста. Этиоляция пролиферирующих культур при пониженных температурах в дальнейшем увеличива­ла укоренение побегов на среде с ИМК и уменьшала - на среде с культаром и мивалом. Композиционная среда спо­собствовала укоренению побегов яблони после 4-го пассажа, увеличению коли­чества корней 2-го порядка, площади листьев, стимулированию развития надземной и корневой системы на среде с 6 БАП (6 мг/л).

4. Структурная среда, состоящая из перлита и агара в соотношении 0,5-1:1 по объему, способствует получению хорошо развитой корневой системы земляники, позволяет уменьшить кон-цетрацию агара в 3 раза.

5. Тип и концентрация углеводов в среде оказывает влияние на характер ризогенеза растений. Наиболее прием­лемыми следует признать сахарозу и глюкозу.

Библиографический список

1. Алабина О.Н. Обоснование способов подготовки маточных растений ягодных

кустарников к вегетативному размножению: /О.Н. Аладина/ Дис. докт. с.-х. наук: 00.01.07. М., 20О4.

2. Катаева Н.В. Особенности микроразмножения трудноукореняемых со-

ртов яблони /Н.В.Катаева // Сельскохозяйственная биология. М., 1986. Вып. 4.

3. Кефели В.И. Онтогенез. М., 1970.

4. Орлов П.Н. Роль перивискулярных волокон в образовании придаточных кор­ней у зеленых черенков садовых растений // Плодоводство ТСХА, 1985. Вып. 6. С. 102-115.

5. Abbott A.J. Culture of Mallus tissues in vitro multiplication of apples plants from isolated shoot apices// Sci. Horticult, 1976. № 4. P. 183-185.

6. Amitrani A. et al. Influence of the moment of application of IBA and darkness on in vitro rooting of M27 // Agr. Med. Vol, 1989. № 119. P. 417-423.

7. Bartoline G. The effects of regulators of ethylene synthesis on rooting of Olea European L. cuttings // Acta Horticult, 1986. V. 8.

8. Brian C.H.,Hicks G. Micropropagation of the Cold-hardy apple rootstock KSC-3 // Can. J. of Plant Sci., 1989. V. 69. № 2. P. 555-564.

9. Cardenas bare. Alicia et al. Potencial osmotica del medio de cultivocon differ-ents components parala propagation in vitro // Rev. fito teen. Мех., 2002. V. 25. № 2. P. 213-217.

10. Chu C.J. Effects of micropropagation techniques on guowth and development of miniature roses // Hort. Sci., 1990. V. 25. № 3.

11. Dennis P., Stmart et al. In vitro shoot proliferation of Pyrus calleriana from vegetative Buds // Hort. Sci., 1989. V. 24. № 2. P. 298-299.

12. Doolan D.W., Hennerby M.J., Moorgan J.V. Culture of micropropagated

strawberry plants in nutrient film technique // Acta. Horticult, 1983. № 133.

13. Druart P. In vitro promotion of root formation by apply shoots trough darkness effect on endogenous phenols and peroxidases // Z. Pflanrenphysiol, 1982. № 1085. P. 429-436.

14. Eliasson I., Bollmark Marie. Ethylene as possible mediator of light-indu­ced inhibition or root growth // Physiol Plant, 1988. V. 72. № 2. P. 605-609.

15. James D. J. et al. The control of rhizogencsis in vitro in difficult-to-root apple rootstocks // Plant tissue culture, 1982. P. 187-198.

16. Geneve R.L. Root Formation in Cuttings of English Ivy treated with Paclobutra-zol // Hort. Sci.. 1980. V. 25. №6.

17. Kopcewier I. The influence of red light on auxin level in coleoptiles of etiolated seed - lights in two oat varieties // Interact. Plant Symp. Occas, 1985. V. 175. P. 47-48.

18. Nicholas I.R. The use of fluorescence microscopy to monitor root development in micropropagated explant // J. of Hort. Sci., 1986. V. 61. №4. P. 417-421.

19. Pliego-Alfare F.J. Development of in vitro rooting bioassay using juvenile stem cuttings of Persea americane Mill // Hort Sci., 1988. V. 63. №2. P. 295-301.

20. Raphael Plus. IAA-induced adventitious root fo rmation in green wood cutting of populas tremula and formation 2-indoline-3acetyeasparatic acid a new metabolite of exogeneo usly applied IAA // Physiol. Plant, 1989. V. 75. P. 86-89.

21. Reiner I. Control of Morphogenesis in Plant Tissue culture by Hormones and Nitrogen Compounds // Plant growth substrances, 1970. P. 686-694.

22. Ripley K.P. et al. Micropropagation of Euphorbia lathyris // Plant. Cell Tissue and Organ Culture, 1986. V. 5. № 3. 213-218.

23. Rugini E. et al. In vitro control of shoot virtification in almond and develop­ment of a technique to Eliminate apex necrosis and shoot base photo-axidation in pistachio // Hort. Sci., 1986. V. 21. №3.

24. Scott E. Sucrose and nitrogen regulation of adventitious root initiation from cultured rose shoot tip // Hort. Sci., 1984. V. 14.

25. Smith D.L. Ethylene associated phase change from juvenile to mature pheno-type of daylily // Phisiol. Plantarum, 1989. V. 76. P. 466-473.

26. Takashi Harada et al. Stades the Morphogenesis of asparagus organ formation in the in vitro culture of segments with a node excited from the shoots seedlings // J. Fac. Agr. Hokkaido Univ, 1983. V. 61. № 3. P. 295-306.

Рецензент - д. с.-х. н. А.В. Исачкин

Results of a long-term investigation into effect of various growth regulators, carbohydrates, passaging duration, agar quality, medium structure, food solution saline composition on root growth are provided in the article. Both stages and duration of rhyzogenesis questions have been discussed. Much consideration is given to the etiolation problem, physical factors, both hormonal and saline composition of nutrient medium. Both true and important data on light and medium composition influence upon rhyzogenesis and viability of plants under unsterile conditions are given in the article.

Key words: in vitro, growth regulators, nutrient medium, etiolation, carbohy­drates, strawberries, apple tree, pear tree, lilac, rose, Chinese actinidia, ash tree.

Деменко Василий Иванович - д. с.-х. Н., РГАУ - МСХЛ имени К.Л. Тимиря­зева. Тел. 976-21-98.

Лебедев Вадим Григорьевич - к. б. н., Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова РАН.

Шестибратов Константин Александрович - к. б. н., Институт биоорганиче­ской химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Клетки стареют не только in vivo, но и in vitro. Более того, в условиях in vitro особенно отчётливо проявляется роль гипероксии – естественного и, по-видимому, единственного в этих условиях фактора их старения.
1.8.1. Как известно, выращивание клеток вне организма проводится в специальных сосудах (флаконах) при атмосферном давлении и, следовательно, при рО2, значительно превосходящем значения, которые устанавливаются в организме в норме. Обычно в инкубационной жидкости рО2 близко к рО2 воздуха. Молекулы О2 через тонкий слой питательной среды во флаконе свободно диффундируют к клеткам и внутри них устанавливается высокое рО2, невозможное in vivo или, во всяком случае, превышающее допустимые значения.
С точки зрения кислородно-перекисной концепции старения, условия in vitro представляются более чем подходящими для изучения процесса старения клеток, так как в этих условиях он протекает интенсивнее, в ускоренном темпе и, что очень важно, в «чистом» виде, т.е. при полном отсутствии какого-либо влияния систем организма, которое имеет место при старении in vivo. Данное обстоятельство сразу ставит многие теории старения в разряд второстепенных или сугубо умозрительных, поскольку возрастные изменения происходят или могут происходить и без реализации постулируемых в них положений. Придание нами столь важного значения феномену старения клеток in vitro связано с тем, что именно в этих «простых» условиях можно будет скорее и с меньшими трудностями познать физико-химические основы старения и сущность биологии этого процесса вообще.
В настоящее время, однако, не существует единого мнения по поводу общности причин и механизмов старения клеточных культур и старения клеток в составе многоклеточного организма, о чем свидетельствуют противоположные точки зрения в литературе (Капитанов, 1986). Канунго (Kanungo, 1982), например, хотя и считает, что причина старения организма состоит в старении его клеток, вместе с тем полагает: «условия in vitro не соответствуют физиологическим и свойства клеток могут оказаться измененными. Если исследования in vitro и дают некоторую полезную информацию о самой клетке, то они имеют ограниченную ценность, когда речь идёт о старении организма в целом». С приведенным высказыванием можно согласиться лишь отчасти. Действительно, старение клеток in vitro не может отразить весь сложный спектр возрастных изменений, происходящих в целостном организме на всех уровнях и, к тому же, в немалой степени определяемых системой различных связей в нем, в том числе обратных. Применительно к условиям in vitro теряет смысл ряд принципов старения, проявляющихся на организменном уровне (см. п. 1.1.2), но некоторые из них продолжают действовать и в клеточных культурах. Таковы, в частности, многоочаговость процесса старения, т.е. развитие повреждений в различных частях клетки или в различных ее молекулярных циклах, и гетерохронность старения среди клеток одного культивируемого типа. Кроме того, в этих условиях принципы необратимости, нерегулируемости и непрерывности старения клеток должны, очевидно, проявляться более явственно.
Указанные выше недостатки при изучении старения клеток вне организма не представляются принципиальными, если иметь в виду, что одна из основных задач геронтологии состоит в установлении главного первичного фактора ок-ружающей среды, предопределяющего старение всех живых организмов. Таким фактором, как мы полагаем, является гипероксия в земной атмосфере, поэтому жизнь клеток в условиях in vitro можно считать удобной экспериментальной моделью для изучения действия именно указанного физического фактора на их старение. Обычное 18-21 %-ное содержание О2 в воздухе и соответственно высокие уровни дисбаланса Δ (ПО – АО) и пероксигеназных процессов оказывают угнетающее действие на субклеточные элементы, на нормальные физиологические и метаболические процессы. В результате последние постепенно затухают, и большинство клеток погибает вследствие окислительного цитолиза или по кислородно-перекисному механизму апоптоза (см. п. 7.1).
Фактов, указывающих на ведущую роль избыточных рО2, АФК и ПОЛ в снижении выживаемости клеток в условиях in vitro и протекторного действия различных антиоксидантных факторов, более, чем достаточно (Branton et al., 1998; Drukarch et al., 1998; Heppner et al., 1998). К числу последних отнесен недавно и L-карнозин. Добавление физиологических концентраций его к стандартным средам увеличивает продолжительность жизни фибробластов челове-ка in vitro и замедляет процессы физиологического старения в них. Длительно пассируемые на обычных средах клетки после переноса их в карнозин-содер-жащую среду проявляли омолаживающий эффект. Оптический же изомер D-карнозин не обладал указанными свойствами (Холлидей, МакФарланд, 2000) В то же время в ходе длительного культивирования определённый процент клеток не только не деградирует, но и, адаптируясь к токсическим окислительным условиям, «добивается» того, что внутриклеточный параметр Δ (ПО – АО) не повышается до высоких значений ΔА2 или ΔЦ, но может остановиться на несколько меньшем уровне ΔК, необходимом для их злокачественной трансформации. Случаи «спонтанной» малигнизации клеток в культуре и возможный ее механизм обсуждаются нами отдельно в главе 4.
1.8.2. Приведенные выше соображения можно считать частью наших теоретических положений о причинах и следствиях старения клеток in vitro. Для подтверждения и развития этих положений естественно привлечь некоторые уже известные факты, содержание и смысл которых легко могут быть «вписаны» в кислородно-перекисную концепцию старения клеток. Начнем с того, что вышеописанные обычные условия культивирования клеток, являющиеся для них токсическими, могут быть смягчены путем искусственного снижения концентрации О2 в газовой среде. При этом угнетающее действие гипероксии и скорость старения клеток должны снизиться. Следует также иметь в виду, что такая известная биологическая константа, как лимит Хейфлика, в действительности оказалась переменной величиной, зависящей от содержания О2 в газовой среде, причем в условиях оксидативного стресса этот лимит уменьшается, а при снижении рО2, напротив, возрастает (Chen et al., 1995).
Действительно, пребывание культуры фибробластов в атмосфере с пониженным содержанием О2 (10 %) удлиняет срок их жизни на 20-30 %. То же происходит и с клетками легких человека и мышей (Packer, Walton, 1977). Период пролиферативной жизнеспособности диплоидных фибробластов IMR90 человека с различными исходными уровнями удвоения популяции увеличива-ется при снижении содержания О2 в среде до 1,6 или 12 %. Этот период при 1 % О2 возрастает на 22 %, а возвращение культур из среды с 1 % О2 в среду с 20 % О2 быстро развивает их старение. В культуре диплоидных фибробластов от больного синдромом Вернера (раннее старение) продолжительность репликативной жизнеспособности также возрастает при снижении рО2 (Saito et al., 1995). Замедление старения культивируемых хондроцитов куриного эмбриона показано при 8 %-ном содержании О2 в атмосфере по сравнению с контролем (18 %), причём опытные клетки дольше сохраняли признаки «молодых», имели более высокую скорость пролиферации (Nevo et al., 1988). Под влиянием различных антиоксидантов скорость пролиферации клеточных культур также уве-личивается, а старение их замедляется (Packer, Walton, 1977; Обухова, 1986), что подтверждает уже сказанное выше: явно избыточное действие оксидантов подавляет пролиферацию клеток и обусловливает ускоренное их старение.
В экспериментах с клеточными культурами сравнительно легко проверить также действие О2-зависимого механизма регуляции количества дыхательных ферментов (Murphy et al., 1984; Suzuki et al., 1998) и митохондрий (Озернюк, 1978). Согласно этому механизму, при плавном и медленном возрастании уро-вня гипероксии содержание таких ферментов и число митохондрий должны постепенно нарастать, а при гипоксии, наоборот, – падать. Действительно, при выращивании культуры фибробластов на среде с пониженным содержанием О2 концентрация цитохромов значительно снижается (Pius, 1970). Здесь, безусловно, задействован объективный процесс адаптации дыхательной системы к внутриклеточному уровню рО2. Однако в данном феномене не меньшее значение имеет скорость адаптации, от которой будет зависеть и интенсивность старения культивируемых клеток. Кажется очевидным, что в процессе биологической эволюции многоклеточный организм приспосабливался к постепенному нарастанию рО2 в земной атмосфере также постепенно. При этом внутри клеток самым эффективным можно считать «митохондриальный» механизм адаптации: количество ферментов дыхательной цепи и самих митохондрий варьируется самоорганизующейся системой так, чтобы оно обеспечивало целостность и относительно нормальное функционирование клеток при изменениях внутриклеточного рО2 в определённых эволюционно апробированных уже пределах.
Совсем иная ситуация складывается при быстром перенесении клеток из живого организма в условия in vitro. Резкий перевод их в состояние гипероксии равносилен нанесению им значительного скачкообразного возмущающего воз-действия, к которому они, вообще говоря, не подготовлены. Как же реагирует первичная клеточная культура на такое возмущение? По-видимому, на протяжении определенного начального периода культуральная среда является для клеток «стрессовой», а состояние самих клеток в этот период – шоковым. Затем какое-то время затрачивается на подготовку и проведение возможных в этих экстремальных условиях адаптивных «мероприятий» антиоксидантного характера. Вероятно, за счёт последних на первых порах удается не только избежать окислительной деградации, но и создать условия для стимуляции пролиферативного процесса, снизив высокий вначале явно «цитотоксический» внутриклеточный дисбаланс ΔЦ (ПО – АО) до необходимого для окислительного митогенеза. Однако и эта стадия в жизни первичной культуры не может не ограничиваться непрерывно угнетающей ее гипероксической средой. В данной ситуации начинает инактивироваться сам адаптивный механизм, соответственно снижается наращивание антиоксидантной системы, а в последующем про-исходит и регрессия последней. При высоком уровне ПОЛ, прежде всего, повреждаются митохондрии (см. п. 1.3), количество которых продолжало бы возрастать как приспособительный акт в случае постепенного повышения рО2 в газовой среде.
Неспособность адаптивных механизмов клетки к быстрой и полной нейтрализации внезапно возникшей гипероксии, с одной стороны, и высокая уязвимость митохондриального звена при пероксидативных стрессах, с другой, определяют необратимый процесс дегенерации клеток после возникновения в них «критического уровня» повреждений. Важно здесь ещё раз отметить: деструктивные изменения именно в митохондриях как основных потребителей О2 и в этом смысле как главной, антикислородной ступени защиты в антиоксидантной системе клетки не оставляют надежд на выживание для большинства клеток в жестких условиях in vitro, поскольку в этом случае расстраивается сам адап-тивный механизм снижения внутриклеточного рО2 и уровня ПОЛ. Приведенные соображения полностью согласуются с первичной ролью изменений митохон-дрий в инициации механизма старения, постулированной, правда, примени-тельно к культивируемым in vitro фибробластам (Kanungo, 1980).
Пероксидативный стресс и токсический эффект в условиях in vitro могут быть ещё более усилены, если в культуральную среду ввести катализаторы ПОЛ, например ионы Fe2+ или Cu2+. Действительно, добавление в среду культивирования сульфата меди в концентрации 60 мг/л приводило к достоверному снижению средней продолжительности жизни коловраток на 9 %, а также к существенно более заметному, чем в контроле, нарастанию количества MDA. Авторы этого эксперимента (Enesco et al., 1989) логично полагают, что сокра-щение продолжительности жизни происходит вследствие ускорения ионами меди процессов генерации свободных радикалов. Указанная концентрация сульфата меди оказалась оптимальной, так как бoльшие (90 и 180 мг/л) были слишком токсичными для коловраток, а меньшая (30 мг/л) – малоэффективной.
Таким образом, необратимые ускоренные старение и окислительная деградация клеток при резкой смене среды обитания с in vivo на in vitro являются следствием недостаточной готовности их без серьезных негативных последствий воспринять столь крутое усиление кислородного воздействия. Если такой резкий перевод в новые условия заменить «мягким», например, многоступенчатым и растянутым во времени, то можно ожидать, что присущая клеткам способность адаптироваться к постепенно нарастающей гипероксии в этом случае реализуется в полной мере. Более того, в принципе таким способом можно добиться адаптации клеток не только к обычному 18-21 %-ному уровню О2 в атмосфере, но и к существенно превышающим его искусственно создаваемым гипероксическим средам. В подтверждение сказанному сошлемся на весьма убедительные факты, полученные Велком с соавт. (Valk et al., 1985). В результате постепенной адаптации к возрастающей концентрации О2 ими получена линия клеток яичника китайского хомячка, устойчивая к высокому содержанию О2 и способная пролиферировать даже при 99 % О2 в атмосфере. К столь значительной гипероксии и зависимым от нее процессам оказались адаптированными все ступени защиты – антикислородная, антирадикальная и антиперекисная (подробнее об этих результатах см. в главе 4).
1.8.3. Изложенные соображения об особенностях изменения прооксидан-тно-антиоксидантного дисбаланса в культивируемых клетках как основного действующего фактора их старения и трансформации можно условно представить графически (см. рис. 11). На кривой 1, отражающей указанные изменения при быстром перемещении клеток в среду in vitro, выделены три последо-вательные во времени этапа, которые, похоже, соответствуют известным в литературе адаптационной (латентной) фазе, фазе логарифмического роста и стационарной фазе. При этом старение клеточных культур обычно связывается с процессами в стационарной фазе, где со временем они претерпевают различные изменения, сходные с наблюдающимися в клетках в составе стареющего организма (Капитанов, 1986; Хохлов, 1988). В частности, при старении клеток in vitro изменяются ферменты, происходит их анэу- и полиплоидизация (Re-macle, 1989). Как и клетки in vivo, культивируемые клетки по мере старения накапливают липофусциновые гранулы (Обухова, Эмануэль, 1984), указывая на очевидное протекание перекисных процессов и окислительные нарушения в структуре липидов и белков. Эти и ряд других фактов так или иначе могут быть согласованы с гипотезой о кислородно-перекисном (свободнорадикальном) ме-ханизме старения. Более же всего, в пользу такого механизма свидетельствуют данные о том, что при повышении концентрации антиоксидантов продолжительность жизни клеток in vitro больше, а при понижении – меньше, чем в контроле. Такие результаты получены, например, при изменении содержания GSH в фибробластах человека (Shuji, Matsuo, 1988), каталазы и SOD – в куль-тивируемых нейронах (Drukarch et al., 1998).
Что касается пологих и тносительно плавно возрастающих кривых 2 на рис. 11, то такой характер их объясняется тем, что за каждым небольшим искусственно создаваемым приращением прооксидантной составляющей дисбаланса Δ (ПО – АО) в клетке следует с некоторым запаздыванием соответствующее адаптивное приращение в ней антиоксидантной компоненты. Многократ-ное повторение этой акции и обеспечивает приспособление и выживаемость клеток при постепенном, ступенчатом повышении уровня гипероксии.
В обоих указанных случаях обратим внимание на варианты, ведущие к так называемой «спонтанной» малигнизации клеток (см. главу 4). Этот феномен, с нашей точки зрения, может реализовываться лишь в тех клетках, где дисбаланс достигает значений ΔК, устойчиво удовлетворяющих неравенству (см. п.1.1.2)
ΔП (ПО – АО) а точнее, с учетом «апоптозных» дисбалансов, – соотношению (см. п. 7.1.1)
ΔА1 (ПО – АО) С помощью подобных процедур, в конечном счете, формируются перевивные линии трансформированных и опухолевых клеток, способных к длительному существованию вне организма. В контексте же рассматриваемых нами проблем более важно определиться с подходом к исследованию взаимосвязи старения и канцерогенеза. Один из них, а именно изучение самого процесса появления опухолевых клеток в ходе старения нормальных клеточных культур (Witten, 1986), представляется наиболее естественным и потому предпочтительным

подходом. При установлении дисбаланса Δ (ПО – АО) в промежутке между ΔК и ΔЦ клетки могут подвергаться апоптозу типа А2 (см. п. 7.1.1).
Согласно теломерной теории, репликативное старение клеток, в том числе и в условиях in vitro, связано с укорочением теломер после каждого митоза, вплоть до некоторой минимальной длины, результатом чего является утрата такими клетками способности к делению (см. п. 1.4.3 и 1.4.4). Анализ известной литературы по этому вопросу показывает, что данный постулат в некоторых случаях не подтверждается. Примером тому служат исследования Кармана и соавт. (Carman et al., 1998), проведенные на диплоидных эмбриональных кле-тках сирийского хомячка (SHE). Эти клетки после 20-30 циклов удвоения прекращали пролиферацию, теряли способность вступать в S-фазу после стимуляции сывороткой. В то же время клетки SHE экспрессировали теломеразу в течение всего репликативного жизненного цикла, а средний размер теломер не уменьшался. Выходит, что in vitro клетки могут иногда стареть по механизмам, не связанным с потерей теломер.
Как представляется нам, в указанном случае свои коррективы вносят условия гипероксии в среде культивирования. Если в состоянии умеренно повышенного уровня АФК и пероксидация выполняют нередко позитивные функции, активируя отдельные этапы прохождения митогенного сигнала, реплика-ции, транскрипции и иных процессов (об этом говорилось в ряде предыдущих параграфов и упоминается в некоторых последующих), то в случае интенсивного окислительного стресса неизбежны и негативные последствия. Например, часть макромолекул, в том числе участвующих в митогенезе, может быть модифицирована, что, независимо от активности теломеразы и длины теломер, дол-жно ингибировать пролиферацию и/или индуцировать какие-то другие нарушения, вплоть до приводящих к гибели клеток.
Как бы там ни было, две причины старения клеток in vitro – накопление ошибок в условиях содержания их в культуре и укорочение теломер – остаются все же наиболее вероятными. Полагают, что в обоих случаях активируются системы белков р53 и Rb, а при нарушении их функции происходит трансформация клеток (Sherr, DePinho, 2000). В более общем плане нам видится следующее: в токсических гипероксических условиях культивирования норма-льные клетки, старея, претерпевают, скорее всего, апоптоз А1, а опухолевые клетки – апоптоз А2. В случае неполадок в механизме апоптоза первые подвергаются неопластической трансформации, вторые же – окислительному цитолизу (см. п. 7.1.1).
Дополнительной причиной, способствующей усилению процессов окислительной деструкции в клетках in vitro, может считаться и тепло, как постоянно действующий фактор окружающей среды. Действительно, с помощью высоко-чувствительного метода (описание его приводят авторы Брусков и др., 2001) было показано, что под действием тепла в водных растворах генерируются АФК. В результате тепловой активации растворенного в воде атмосферного О2 протекает последовательность реакций
О2 → 1О2 → О → НО2˙ → Н2О2 → ОН˙.
Образующиеся АФК, по-видимому, и содействуют тепловому повреждению ДНК и других биологических молекул путём их «автоокисления».
Наконец, отметим еще один способ интенсификации процесса старения клеток в условиях in vitro с помощью процедуры аноксии – реоксигенации, результаты которой, по нашему мнению, наиболее выражено отражают суть кислородно-перекисной модели старения. Основу механизма старения в данном случае составляют два принципиальных эффекта: адаптивное сокращение (ослабление) митохондриальной базы в период аноксии или гипоксии (см. выше); значительное усиление ПОЛ и других процессов окислительной деструкции при последующей реоксигенации вследствие резкого повышения рО2 (относительно состояния аноксии) и невозможности быстрой утилизации избыточного О2 «аноксическими» митохондриями. Степень пероксидативного стресса и, сле-довательно, скорость старения клеток будут зависеть от длительности пребывания их в состоянии аноксии: чем продолжительнее этот период, тем лучше сможет адаптироваться митохондриальная база к низкому уровню рО2 и тем значительнее будет урон клеток после устранения ишемии.
Примером реализации старения клеток по указанному «сценарию» может служить следующий факт. Гепатоциты, выделенные у крыс разного возраста, подвергали 2-часовой аноксии и 1-часовой реоксигенации. Установлено, что в реоксигенационной фазе гепатоциты продуцируют большое количество кислородных радикалов, ответственных за повреждение их мембран и за другие при-частные к старению структурно-функциональные изменения, причем старые клетки были чувствительнее к реперфузионной травме (Gasbarrini et al., 1998). Подобного рода факты рассматриваются нами и в главе 4 в связи с обсужде-нием механизма старения и «спонтанной» малигнизации клеток в культуре.

19713 0

Любая ткань растений - это сообщество клеток, и если она изолирована (выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей (клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения их полноценного питания и развития.

Тогда при строгом соблюдении этих условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные исходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использования. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических условиях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации ее генетической информации.

Смещая в эксперименте временную реализацию генетической информации (с помощью гормональных воздействий), можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремальных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направлении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую неустойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетерогенностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут быть исходным материалом для селекции.

Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера), микроэлементы - в микромолярных (железо, бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина, мезоинозит и др.).

В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и твердые питательные среды.

Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар (0,7-1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Обычная его концентрация - 8-10 г на литр среды. Агар обеспечивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани. Вместо агара можно использовать биогели.

Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН среды может варьировать от 5,2 до 6,6.

Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения.

Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10 М. Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера.

Микроэлементы составляют в среде концентрации 10-6 М. Присутствие их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы.

Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор.

Органические составляющие сред. Согласно многочисленным данным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей подсолнечника, табака, топинамбура и др.

В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина - источник аминокислот.

В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин.

Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы -токсичны, L-формы - пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетающее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде.

Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензионных культурах.

Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в большинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию.

Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл.

При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлорофилла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращивать на питательной средах, содержащих сахар.

При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на питательную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться.

Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани, взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде. При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообразующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара. Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани.

Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной среде составляет 2-5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахарозы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культивирования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур (травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с глюкозой.

На третьем месте по эффективности использования культурами тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста 2/3 культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и органов растений.

В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более богатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос приводит к некрозам тканей.

Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влияние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увеличении осмотического потенциала среды.
Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие сахаров. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается образование веществ, стимулирующих рост тканей.

Выращивание хлорофиллоносных и лишенных хлорофилла тканей на свету или в темноте изменяет как содержание растворимых сахаров в ткани, так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света также сказываются на углеводном метаболизме тканей.

Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синтезируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследования показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.

В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами. По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после слабого роста ткани в предыдущем пассаже.

Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи метаболизма различно.

Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды.

Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственными средами.

В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.

Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред определяется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1, табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие количества калия, фосфора и микроэлементов.

Таблица 4.1. Примеры составов наиболее употребляемых питательных сред для культивирования растительных клеток тканей

В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток. Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1), отличающиеся набором отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и российскими фирмами.

Таблица 4.2. Состав среды Мурасиге-Скуга

МС - самая универсальная среда, пригодная для образования и роста каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова

В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.

Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т.д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т.д.). Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстроувеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М. Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).

Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.

Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологичеки активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов – эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов.

Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.

Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.

Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro. Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления.

Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей–использование ее в клеточной селекции.

Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны. Иногда, например, при селекции гречихи, трудно воспроизвести в потомстве уникальные генотипы из-за перекрестного опыления культуры. Поэтому перед исследователями часто встает задача – размножить и сохранить полученные растения. В этом помогает метод клонального микроразмножения. Размножают гибриды путем активации развития меристемы пазушных почек (черенкованием стерильных побегов), адвентивными почками или регенерацией растений из каллусной ткани, в частности полученной при культивировании зародышей.

Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.

В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах. Особь обычно гетерозиготна (два гена различаются), при этом проявляется действие только доминантного (но не рецессивного) гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков.

Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения.

Гаплоиды могут возникать спонтанно, но частота их спонтанного возникновения очень мала. Искусственным путем с Использованием методов in vitro удается получить большие количества гаплоидных растений. Существует три способа получения гаплоидов с использованием метода культуры изолированных тканей:

андрогенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор.

гиногенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек;

партеногенез – получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.

Образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского генома гаплоидные эмбриоиды культивируют на искусственных питательных средах и получают гаплоидные растения. Сорта ячменя Исток и Одесская-15 были получены комбинацией партеногенетического метода с культурой изолированных зародышей за четыре года вместо обычных 10–12 лет. Методом культуры пыльников из сортов и гибридов мягкой и твердой пшеницы в НПО «Элита Поволжья» за четыре года получено более 2,5 тыс. дигаплоидных линий, которые характеризуются гомогенностью и стабильностью.

Продолжается разработка технологии получения гаплоидов посредством культуры пыльников пшеницы, ячменя, кукурузы, озимой ржи, картофеля. В культуре пыльников возможны два пути образования гаплоидных растений. Первый – образование растений путем эмбриогенеза в пыльцевых зернах. При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и дают гаплоидные растения. Второй – образование каллуса из клеток пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток.

Гаплоиды, полученные in vitro, могут применяться не только в практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а также по клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некоторых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для опытов по генетической трансформации.

Криосохранение растений

Криосохранение соматических клеток растений в жидком азоте (температура – 196° С) – новое направление в биотехнологии, которое широко стало развиваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии заключается в сохранении в культуре in vitro генофонда, а также в обеспечении селекционеров в любое время генотипом, имеющим искомые признаки: необходимая пыльца для проведения гибридизации; уникальные и единичные семена, в том числе не выносящие обезвоживания; трансформированные, мутантные, гибридные клетки разных видов растений, способных к морфогенезу in vitro; зиготические и соматические зародыши и т.д. В настоящее время разработаны условия криосохранения для культивируемых клеток более 30 видов, каллусных культур (около 10 видов), изолированных протопластов (8 видов), сохранения меристем (25 видов) и кончиков стебля (13 видов). Приоритет в этом направлении принадлежит Институту физиологии растений РАН и, в частности, отделу культуры тканей и морфогенеза, возглавляемому проф. Р. Г. Бутенко.

При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде всего, учитывать специфику растительных клеток: отбирать мелкие клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды; разрабатывать в каждом отдельном случае подходы замораживания и последующего оттаивания растительных клеток. При криосохранении встречается ряд трудностей, одна из которых связана с защитой замораживаемых клеток и тканей от осмотического стресса и механического разрушения структур в результате образования и роста кристаллов льда внутри клетки. Одновременно с этим необходимо правильно подбирать условия, обеспечивающие высокую выживаемость клеток при оттаивании и рекультивации.

Несмотря на многообразие работ в этом направлении, в них все же наметились общие приемы, лежащие в основе криосохранения: обработка клеток перед замораживанием, применение криопротекторов, соблюдение определенного режима замораживания в интервале от 0 до –40° С (в редких случаях до -70° С), а также специальные предосторожности при оттаивании объектов.

Процесс криоконсервации, как правило, начинается с подготовки культуры клеток к замораживанию. Это может быть достигнуто несколькими способами, предусматривающими культивирование клеток на питательных средах, содержащих различные осмотически активные вещества: маннит или сорбит в концентрации 2–6%, аминокислоты и среди них, в первую очередь, пролин, чье значение для связывания воды в клетках растений широко известно, а также у-аминомасляная кислота.

Подбор криопротекторов, веществ, уменьшающих повреждение клеток от осмотического и механического стресса, проводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Среди всех известных криопротекторов выделяются такие легко проникающие в клетки вещества, как диметилсульфоксид (ДМСО, 5–10%), глицерин (10–20%), а также непроникающие высокомолекулярные–поливинилпиролидон (ПВП), декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000.

Большое значение при криосохранении имеет правильно подобранный режим замораживания от 0 до –40° С. Как правило, для всех объектов устанавливается скорость замораживания 0,5–1 °С в минуту и всю эту работу проводят на специальном оборудовании, обеспечивающем программное замораживание. Такие приборы выпускает специальное конструкторское технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины (г. Харьков).

Таким образом, медленное замораживание и использование криопротекторов позволяет освободить клетку от свободной воды, и при –40° С клетки становятся полностью обезвоженными, что дает возможность проводить дальнейшее замораживание, а именно погружать ампулы с растительным материалом в жидкий азот.

Хранение материала в жидком азоте практически не лимитировано. Например, в криобанке Института физиологии растений РАН хранятся клетки моркови, которые находятся в жидком азоте около 20 лет, меристемы картофеля – более 10 лет и др.

Оттаивание и проверка жизнеспособности клеток после хранения в жидком азоте является последним этапом технологии криосохранения. Если замораживание осуществляют медленно, постепенно, то оттаивание должно быть проведено как можно быстрее. Для этого ампулы помещают в водяную баню с температурой 40°, а иногда и 60° С и выдерживают до полного исчезновения последнего кристаллика льда.

Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания применяют наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ – окраска витальным красителем (0,1%-ным феносафранином или 0,25%-ным раствором сини Эванса), в результате которой мертвые клетки окрашиваются, а живые нет. Окончательным критерием, безусловно, служит четкое возобновление роста и деления клеток при рекультивации на искусственных питательных средах после оттаивания.

Экспериментально было показано, что клетки после хранения в жидком азоте не теряют способности к делению, регенерации растений, не уменьшается продуктивность синтеза вторичных метаболитов (клетки продуценты) и т.д. Так, Институтом физиологии растений РАН совместно с НПО по картофелеводству разработаны методы криосохранения меристем четырех сортов картофеля и показана возможность из 20% хранящихся меристем регенерировать целые растения, которые при высадке в поле не отличались по всем признакам, включая темпы роста и продуктивность, от обычных пробирочных растений (С. Манжулин и др., 1982). Более подробно о технике криосохранения можно узнать из обзорных работ А. С. Попова.

Таким образом, технология, связанная с криосохранением растительных объектов, развивается и постоянно совершенствуется. Несомненно, эта технология имеет свое будущее, так как уже сегодня криобанки могут значительно облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов, в том числе старой селекции и диких видов, а также исчезающих видов растений.